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Signalisation dans les phagocytes


Permanents : Oliver Nüsse (PR), Sophie Dupré (MC), Elodie Hudik (AI)

Les polynucléaires neutrophiles forment une barrière importante de la défense contre les infections. Ainsi lors d’une infection, les neutrophiles circulants sont attirés par chimiotactisme sur le lieu d’infection, puis phagocytent les pathogènes. Une fois phagocytée, la bactérie va être détruite dans le phagosome par les radicaux libres oxygénés (« ROS ») synthétisés principalement par la NADPH oxydase. L’inflammation aigue se termine normalement par l’apoptose de ces leucocytes. La réduction voir l’absence des neutrophiles (« neutropénie ») ou la non-fonctionnalité de la NADPH oxydase (« granulomatose chronique ») empêche la destruction de l’agent pathogène. A l’inverse la suractivité du neutrophile qui peut persister dans le temps, peut être responsable d’inflammation chronique. Fig. 1 - Accumulation de p67phox (anneau rouge) autour d’un phagosome

La NADPH oxydase (Nox2) est composé de sous-unités cytosoliques (p67phox, p47phox, p40phox et Rac) et membranaires (gp91phox et p22phox) qui s’assemblent à la membrane du phagosome. Nous analysons l’organisation spatio-temporelle de cet assemblage à l’aide de méthodes de vidéo-microscopie à fluorescence. En parallèle, nous étudions la production phagosomale des ROS. L’objectif est de comprendre la signalisation intracellulaire qui contrôle ces évènements. Nous étudions notamment le rôle des phospholipides anioniques (phosphoinositides et phosphatidylsérine) qui apparaissent comme des régulateurs potentiels. Kinases et phosphatases cellulaires modifient rapidement et localement les phosphoinositides et servent ainsi à contrôler l’activité de la NADPH oxydase. En effet, plusieurs sous-unités lient spécifiquement certains phosphoinositides ce qui leur permet de s’attacher à la membrane et interagir avec Nox2.

Nous focalisons nos études sur le modèle des cellules PLB985. Nous avons mis au point des techniques de transfection (stable et transitoire), de différenciation (neutrophile- ou macrophage-like) et des tests de fonction (production de ROS, phagocytose, exocytose). Nous exprimons les sous-unités de la NADPH oxydase taggées avec des protéines fluorescentes (GFP, citrine, mCherry) afin de suivre leurs localisations et interactions pendant la phagocytose par vidéo-microscopie.

La quantification des ROS, notamment à l’intérieur du phagosome, est un défi technique majeur. Nous participons au développement et à la caractérisation de nouveaux détecteurs de ROS, notamment ceux basés sur des protéines fluorescentes.

Certains pathogènes bactériens ou fongiques survivent à l’intérieur des phagocytes. Leurs mécanismes de résistance sont mal compris, mais constituent des cibles thérapeutiques potentielles. Afin de résister au ROS dans le phagosome, les pathogènes peuvent inhiber la production, par exemple par interférence avec la signalisation du phagocyte, ou détoxifier les ROS. Nous souhaitons mieux comprendre ces mécanismes de résistance en utilisant les techniques d’imagerie à fluorescence au niveau cellulaire et en mesurant la production des ROS à l’intérieur du phagosome grâce aux outils que nous développons.

Mots-Clés : Phagocytes, NADPH oxydase, radicaux libres, translocation de sous-unités, protéine fluorescente, biosenseur, phosphoinositide, vidéo-microscopie, inflammation, pathogène intracellulaire.

L’équipe : Leïla Bouchab (PhD), ZhiMin Song (PhD).

Collaborations :
- Institut des Sciences Moléculaires d’Orsay, Orsay
- Imagerie Gif, Gif-sur-Yvette
- Sanquin Institute, Amsterdam, Pays-Bas