Signalisation dans les phagocytes
Permanents : Oliver Nüsse (PR), Sophie Dupré (MC)
Les polynucléaires neutrophiles forment une barrière importante de la défense contre les infections. Ainsi lors d’une infection, les neutrophiles circulants sont attirés par chimiotactisme sur le lieu d’infection, puis phagocytent les pathogènes. Une fois phagocytée, la bactérie va être détruite dans le phagosome par les radicaux libres oxygénés (« ROS ») synthétisés principalement par la NADPH oxydase. L’inflammation aigue se termine normalement par l’apoptose de ces leucocytes. La réduction voir l’absence des neutrophiles (« neutropénie ») ou la non-fonctionnalité de la NADPH oxydase (« granulomatose chronique ») empêche la destruction de l’agent pathogène. A l’inverse la suractivité du neutrophile qui peut persister dans le temps, peut être responsable d’inflammation chronique.
La NADPH oxydase (Nox2) est composé de sous-unités cytosoliques (p67phox, p47phox, p40phox et Rac) et membranaires (gp91phox et p22phox) qui s’assemblent à la membrane du phagosome. Nous analysons l’organisation spatio-temporelle de cet assemblage à l’aide de méthodes de vidéo-microscopie à fluorescence. En parallèle, nous étudions la production phagosomale des ROS. L’objectif est de comprendre la signalisation intracellulaire qui contrôle ces évènements. Nous étudions notamment le rôle des phospholipides anioniques (phosphoinositides et phosphatidylsérine) qui apparaissent comme des régulateurs potentiels. Kinases et phosphatases cellulaires modifient rapidement et localement les phosphoinositides et servent ainsi à contrôler l’activité de la NADPH oxydase. En effet, plusieurs sous-unités lient spécifiquement certains phosphoinositides ce qui leur permet de s’attacher à la membrane et interagir avec Nox2.
Nous focalisons nos études sur le modèle des cellules PLB985. Nous avons mis au point des techniques de transfection (stable et transitoire), de différenciation (neutrophile- ou macrophage-like) et des tests de fonction (production de ROS, phagocytose, exocytose). Nous exprimons les sous-unités de la NADPH oxydase taggées avec des protéines fluorescentes (GFP, citrine, mCherry) afin de suivre leurs localisations et interactions pendant la phagocytose par vidéo-microscopie (Tlili et al. 2012 ; Faure et al. 2013)
Nous avons montré que la présence de PI3P à la membrane du phagosome est essentielle pour le rattachement de p40 ce qui maintient également p67. Cette dernière sous-unité est indispensable pour la production des ROS (Song et al. 2017). La phosphatidylsérine permet le rattachement de p47 et de Rac à la membrane phagosomale et l’inhibition de cette interaction retarde la production des ROS dans le phagosome (Faure et al. 2013).
La quantification des ROS, notamment à l’intérieur du phagosome, est un défi technique majeur en raison de sa composition chimique interne très agressive. Nous participons au développement et à la caractérisation de nouveaux détecteurs de ROS, notamment ceux basés sur des protéines fluorescentes. Nous avons identifié la mCherry comme détecteur de H2O2 potentiel (Nault et al. 2016).
Certains pathogènes bactériens ou fongiques survivent à l’intérieur des phagocytes. Leurs mécanismes de résistance sont mal compris, mais constituent des cibles thérapeutiques potentielles. Afin de résister au ROS dans le phagosome, les pathogènes peuvent inhiber la production, par exemple par interférence avec la signalisation du phagocyte, ou détoxifier les ROS. Nous souhaitons mieux comprendre ces mécanismes de résistance en utilisant les techniques d’imagerie à fluorescence au niveau cellulaire et en mesurant la production des ROS à l’intérieur du phagosome grâce aux outils que nous développons (plateforme SpICy et d’autres instruments du campus).
Mots-Clés : Phagocytes, NADPH oxydase, radicaux libres, translocation de sous-unités, protéine fluorescente, biosenseur, phosphoinositide, vidéo-microscopie, inflammation, pathogène intracellulaire.
L’équipe :
Jérémy Joly, doctorant
Alexandra Zak, doctorante
Collaborations : 
Ladhyx, Ecole Polytechnique, Palaiseau Institut des Sciences Moléculaires d’Orsay, Orsay Imagerie Gif, Gif-sur-Yvette Sanquin Institute, Amsterdam, Pays-Bas
Publications récentes
Tlili, A, Dupré-Crochet, S, Erard, M, Nüsse, O. 2011 Kinetic analysis of phagosomal production of reactive oxygen species Free Rad Biol Med 50 : 438-447.
Tlili, A, Erard, M, Faure, M-C, Baudin, X, Piolot, T, Dupré-Crochet, S, Nüsse, O. 2012, Stable accumulation of p67phox at the phagosomal membrane and ROS production within the phagosome J Leuk Biol 91(1):83-95.
Dupré-Crochet, S, Erard, M, Nüsse, O. 2013, ROS Production in Phagocytes : Why, When and Where ? J Leuk Biol 94:657-670 (review)
Faure, MC, Sulpice, J-C, Delattre, M, Lavielle, M, Prigent, M, Cuif, M-H, Melchior, C, Tschirhart, E, Nüβe, O, Dupré-Crochet, S. 2013, The recruitment of p47phox and Rac2G12V at the phagosome is transient and phosphatidylserine-dependent Biol Cell 105:1-18
Djillani, A, Nüsse, O, Dellis, O. 2014, Characterization of Novel Store Operated Calcium Entry Effectors Biochem Biophys Acta (Mol Cell Res) 1843:2341-2347
Djillani, A, Doignon, I, Luyten, T, Lamkhioued, B, Gangloff, SC, Parys, JB, Nüsse, O, Chomienne, C, Dellis, O. 2015, Potentiation of the Store-Operated Calcium Entry (SOCE) induces phytohemagglutinin-activated Jurkat T cell apoptosis, Cell Calcium, 58(2):171-85.
Nault, L, Bouchab, L, Dupré-Crochet, S, Nüsse, O*, Erard, M* 2016 Environmental effects on ROS-detection – learning from the phagosome Antioxydant and Redox Signaling 25(10):564-76. *corresponding authors
Song, ZM, Bouchab, L, Hudik, E, Le Bars, R, Nüsse, O, Dupré-Crochet, S. 2017, Phosphoinositol 3-phosphate acts as a timer for reactive oxygen species production in the phagosome J Leuk Biol 101:1155-1168.
Erard, M, Dupré-Crochet, S, Nüsse, O. 2018, Biosensors for spatiotemporal detection of reactive oxygen species in cells and tissues, Am J Physiol (Reg Int Comp Phys) 314(5):R667-R683 (review) doi : 10.1152/ajpregu.00140.2017
Dupré-Crochet, S, Erard, M, Nüsse, O. 2018, Kinetic analysis of phagosomal ROS generation, Methods in Molecular Biology, in press