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Ingénierie de nouveaux variants GFP


L’Aquamarine

L’introduction des deux mutations clé de l’Aquamarine permet d’améliorer rapidement, et avec un minimum de perturbations structurales, les nombreux biosenseurs FRET actuellement porteurs d’une ECFP ou d’une Cerulean. Outre un gain en brillance d’un facteur 2, le déclin quasi-monoexponentiel et la longue durée de vie de fluorescence de l’Aquamarine améliorent la quantification du FRET par les techniques de FLIM. L’Aquamarine présente également une stabilité en pH exceptionnelle, avec des propriétés de fluorescence inchangées sur une gamme de pH s’étendant de 4 à 10. Enfin, les réactions de photocommutation réversible sont quasi-indétectables dans l’Aquamarine, ce qui améliore fortement la stabilité de ses signaux.

Imagerie de fluorescence avec l’Aquamarine
Gauche et milieu, adressage membranaire en cellules MDCK ; droite : utilisation comme donneur de FRET dans le biosenseur d’acivité kinase AKAR en cellules BHK. Images d’intensité et de durée de vie obtenues par FLIM-TCSPC sur BIFLUOR, barre = 10μm.

L’Aquamarine est compatible avec des techniques de détection de molécule unique comme la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS), et permet des marquages fluorescents au sein de compartiments cellulaires acides.

 

 

 

 

Références

  • Pasquier H, Merola F, Fredj A, Espagne A, Erard M, Patent Pending (2012).WO 2012/172095
  • Fredj A, Pasquier H, Demachy I, Jonasson G, Levy B, Derrien V, Bousmah Y, Manoussaris G, Wien F, Ridard J, Erard M, Merola F (2012) The single T65S mutation generates brighter cyan fluorescent proteins with increased photostability and pH insensitivity. PLoS One 7:e49149.
  • Erard M, Fredj A, Pasquier H, Betolngar D-B, Bousmah Y, Derrien V, Vincent P, Merola F (2013) Minimum set of mutations needed to optimize cyan fluorescent proteins for live cell imaging. Molecular Biosystems 8:258–267.
  • Mérola F, Fredj A, Betolngar D-B, Ziegler C, Erard M, Pasquier H (2014) Newly engineered cyan fluorescent proteins with enhanced performances for live cell FRET imaging. Biotechnology journal 9:180–191.