Différents biosenseurs basés sur des GFPs sont développés ou étudiés au laboratoire, pour la mesure du pH, la détection d’espèces réactives de l’oxygène ou ROS, le suivi d’activité kinase AMPc dépendante (PKA) ou la détection d’ions métalliques. Différents types d’architecture peuvent être adoptées pour construire ces biosenseurs : en général, un module protéique spécifiquement sensible à l’entité ou l’activité biochimique d’intérêt est fusionné à une ou plusieurs GFPs.
Fig.1 - a) Des ions ou des petites molécules modifient directement le signal de fluorescence de certaines GFP en perturbant leurs propriétés d’absorption ou d’émission. (b) La mutation de quelques acides aminés de surface peut rendre une protéine fluorescente sensible au potentiel redox (cystéines) ou à la chélation d’ions métalliques (histidines). (c) Un domaine senseur capable de répondre par des changements conformationnels à la liaison de substrats peut être greffé sur une protéine fluorescente. (d) Le FRET entre deux protéines fluorescentes permet de détecter les changements de conformation dans des biosenseurs multimodulaires, mais aussi de suivre les interactions protéine-protéine.
Le FRET, ou transfert résonant d’énergie de type Förster nécessite l’utilisation de deux GFPs spectralement adaptées, l’une jouant le role de donneur d’énergie d’excitation (en général une protéine cyan telle que la ECFP ou la Cerulean), l’autre le role d’accepteur (en général une protéine fluorescente jaune). Les changements de conformation du module senseur modifient la configuration relative du donneur et de l’accepteur, et donc le niveau de FRET. Les variations de FRET peuvent être suivies par différentes techniques de microscopie de fluorescence, telles que l’imagerie ratiométrique ou multicouleurs ou le FLIM. Au cours de la thèse de Dahdjim Betolngar, nous avons développé et caractérisé des versions améliorées du biosenseur FRET d’activité kinase AMPc-dépendante AKAR, utilisé notamment pour l’imagerie de l’activité neuronale et cardiaque ex vivo et in vivo.
Références
- Poea-Guyon S, Pasquier H, Mérola F, Morel N, Erard M (2013) The enhanced cyan fluorescent protein : a sensitive pH sensor for fluorescence lifetime imaging. Analytical and Bioanalytical Chemistry 405:3983–3987.
- Betolngar D-B, Erard M, Pasquier H, Bousmah Y, Diop-Sy A, Guiot E, Vincent P, Mérola F (2015) pH sensitivity of FRET reporters based on cyan and yellow fluorescent proteins. Analytical and Bioanalytical Chemistry 407:4183–4193.
- Mérola F, Fredj A, Betolngar D-B, Ziegler C, Erard M, Pasquier H (2014) Newly engineered cyan fluorescent proteins with enhanced performances for live cell FRET imaging. Biotechnology journal 9:180–191.
- Mérola F, Pasquier H et Erard M (2015) Lumières sur le vivant : protéines fluorescentes et senseurs optogénétiques. L’Actualité Chimique 397-398:23
- Mari E, Bousmah Y, Boutin C, Leonce E, Milanole G, Brotin T, Berthault P, Erard M (2019) Bimodal detection of proteins by 129Xe NMR and fluorescence spectroscopy. ChemBioChem, doi.org/10.1002/cbic.201800802